Leptospira metodą PCR

Leptospiroza to odzwierzęca choroba zakaźna wywołana przez krętki Leptospira. Zidentyfikowano ponad 230 gatunków bakterii z rodzaju Leptospira, z których niektóre są chorobotwórcze dla człowieka, a inne nie. Przenosicielami leptospirozy są zwykle zwierzęta domowe oraz gryzonie. Ludzie zarażają się tą chorobą w wyniku kontaktu z zakażoną ziemią, wodą lub poprzez styczność z wydzielinami zarażonych zwierząt. Bakterie wnikają do organizmu przez uszkodzoną skórę. Najczęściej przebieg choroby jest łagodny, dominują niespecyficzne objawy grypopodobne, które po pewnym czasie samoistnie ustępują. Jednak w ciężkich przypadkach choroba może doprowadzić do poważnego uszkodzenia nerek i wątroby (tak zwany zespół Weila), nieleczona może prowadzić do zgonu chorego. W tak ciężkich postaciach niezbędne jest przeprowadzenie dokładnej diagnostyki i jak najwcześniejsze wdrożenie odpowiedniego leczenia. Wśród dostępnych metod diagnostycznych, skuteczną i dokładną, choć stosunkowo kosztowną metodą jest wykrywanie materiału genetycznego bakterii Leptospira za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy PCR.

Diagnostyka leptospirozy

Rozpoznanie zakażenia bakteriami z rodzaju Leptospira nie jest łatwe i najczęściej wymaga zastosowania kilku metod diagnostycznych. Przede wszystkim należy uwzględnić charakterystyczny wywiad epidemiologiczny, mianowicie praca ze zwierzętami, praca w oczyszczalniach ścieków, kąpiele w jeziorach i stawach. Objawy kliniczne nie są niestety specyficzne dla tej choroby. W badaniach laboratoryjnych możemy obserwować wzrost OB i leukocytozę, w przypadku uszkodzenia wątroby wzrost aktywności ASPAT i ALAT, a w uszkodzeniu nerek wzrost stężenia mocznika i kreatyniny we krwi a także wystąpienie białkomoczu i ropomoczu. Można także próbować uwidocznić krętki w bezpośrednim preparacie w mikroskopie z ciemnym polem widzenia, co jednak nie jest łatwe. Większe znaczenie mają próby izolacji i hodowli krętka oraz próby biologiczne na zwierzętach.

Bardzo użyteczne w diagnostyce leptospirozy są badania serologiczne opierające się na wykrywaniu w surowicy krwi chorego specyficznych przeciwciał w klasie IgM i IgG skierowanych przeciwko bakteriom Leptospira.

Jednak najlepszą metodą diagnostyczną, choć wciąż jeszcze rzadko stosowaną ze względu na cenę, jest wykrywanie DNA bakterii Leptospira w próbce krwi lub moczu chorego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy PCR

W największym skrócie przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy PCR polega na bardzo szybkim powielaniu interesującego nas fragmentu DNA, za pomocą enzymu termostabilnej polimerazy DNA, z wykorzystaniem starterów (początkowych i końcowych odcinków komplementarnych do interesującego nas fragmentu DNA) oraz trójfosforanów deoksyrybonukleotydów. Jeśli w badanej próbce znajduje się poszukiwany fragment DNA, to w skomplikowanym procesie przebiegającym ze znacznymi zmianami temperatury reakcji, polimeraza DNA bardzo szybko powieli ten fragment w setkach tysięcy kopii, co pozwoli na jego wykrycie w badanym materiale. Jest to metoda bardzo czuła i pozwala na wykrycie nawet pojedynczych cząsteczek DNA.

Zastosowanie PCR w diagnostyce leptospirozy

Wykrycie w badanej próbce pobranej od pacjenta materiału genetycznego bakterii Leptospira pozwala zdiagnozować leptospirozę i jak najszybciej rozpocząć leczenie choroby. Zaletą metody PCR jest szybkość przeprowadzenia badania (analizę PCR można wykonać już w ciągu kilku godzin). Ponadto jej zaletą w przeciwieństwie do badań serologicznych jest to, że pozwala na wykrycie obecności bakterii już w krótkim czasie po zakażeniu, podczas gdy przeciwciała wykrywane za pomocą testów serologicznych pojawiają się najwcześniej po około siedmiu dniach od zarażenia. Ponadto metoda PCR pozwala różnicować chorobotwórcze i niechorobotwórcze dla człowieka gatunki Leptospiry. Kolejną zaletą jest fakt, że czułość, swoistość i szybkość analizy PCR pozwala na rezygnację z czasochłonnej metody hodowli bakterii, co pozwala na szybkie i pewne postawienie diagnozy. Metoda PCR sprawdza się także u osób leczonych wcześniej antybiotykami, u których hodowla krętków z pobranego materiału jest znacznie utrudniona.