Badanie DNA

PCR (polymerase chain reaction), czyli łańcuchowa reakcja polimerazy dokonała przełomu w badaniach DNA. Technika ta stała się podstawą wszystkich współczesnych badań DNA. Jest to bardzo prosta reakcja wykorzystująca dwa zjawiska przyrodnicze. Po pierwsze w wysokiej temperaturze podwójna helisa DNA rozplata się tworząc dwie oddzielne nici. Drugim aspektem jest fakt, że istnieją enzymy bakteryjne (polimerazy) zdolne powielać DNA i mogące przetrwać w tak wysokiej temperaturze. Tak więc PCR pozwala na dowolnie długie powielanie nici DNA.

W pierwszym etapie polimeraza, oryginalne DNA oraz koktajli nukleotydów (zestaw 4 rodzajów cegiełek z których zbudowane jest każde DNA) są ze sobą mieszane. Drugi etap polega na podgrzaniu całości tak, aby podwójna helisa DNA rozplotła się na 2 oddzielne nici.

W trzecim etapie następuje schłodzenie do temperatury, w której może pracować polimeraza. Enzym ten dobudowuje do każdej z powstałych nici komplementarną nić DNA. Tym sposobem powstają 2. kopie oryginalnego DNA. W kolejnym etapie powtarzane są kroki od 1. do 4. i tworzą się 4 kopie, później 8, 16, 32, 64 i tak dalej, aż do uzyskania oczekiwanej liczby kopii. Oczywiście nie trzeba powielać całej nici. Modyfikując nieznacznie tą technikę można powielić wybrany fragment DNA: jeden lub kilka genów albo fragment niekodujący. Następnie za pomocą chromatografii można się dowiedzieć, czy dany fragment rzeczywiście występuje w danej nici.

Badanie kariotypu nie jest już tak szczegółowe. Jednak to właśnie dzięki temu badaniu można wykluczyć najpoważniejsze zmiany genetyczne - tak zwane aberracje chromosomalne. Chromosomy to specjalna, ściśle uporządkowana i upakowana struktura nici DNA.

Takie skompresowanie materiału genetycznego jest konieczne w czasie podziału komórki. Pozwala podzielić DNA dokładnie na pół i przekazać każdą połowę nowej komórce. Aberracje chromosomalne polegają na przeniesieniu, uszkodzeniu, powieleniu lub odwróceniu większych fragmentów DNA, widoczne w strukturze chromosomu. W takiej sytuacji nie ulegają zmianie pojedyncze geny, ale ich całe zestawy często kodujące tysiące białek. W wyniku aberracji chromosomalnych powstają choroby, takie jak zespół Downa czy białaczka.

Kariotyp polega ocenie struktury wszystkich chromosomów. Aby je zbadać najpierw zatrzymuje się pobrane komórki w fazie podziału, kiedy chromosomy są przygotowane do rozejścia się do dwóch potomnych komórek (są wtedy najlepiej widoczne). Następnie wybarwia się je i fotografuje. Ostatecznie przedstawia się na jednej kliszy wszystkie 23 pary. Dzięki temu wprawne oko specjalisty jest w stanie wyłapać przesunięcia, braki bądź powielenia fragmentów chromosomów.

Badanie kariotypu jest nieodłącznym elementem np. amniopunkcji.

Fish (fluorescent in situ hybridization), czyli fluorescencyjna hybrydyzacja in situ to metoda pozwalająca wybarwić dany fragment DNA. Odbywa się to w prosty sposób. Najpierw syntezowane są krótkie nici DNA komplementarne do szukanego genu lub zestawu genów. Za komplementarne uznaje się fragmenty stanowiące „lustrzane odbicie” badanego genu. Mogą się połączyć tylko z nim, a nie będą pasować w żadnym innym miejscu. Następnie fragmenty te są spajane chemicznie z barwnikiem fluorescencyjnym.

Można na raz przygotować wiele fragmentów komplementarnych do różnych genów i każdy oznaczyć innym kolorem. Następnie w zawiesinie wybarwionych fragmentów zatapia się chromosomy. Fragmenty łączą się specyficznie z odpowiednimi miejscami w badanym DNA. Następnie po skierowaniu na próbkę promienia lasera zaczynają świecić. Wybarwione na kolorowo fragmenty można podobnie jak w kariotypie sfotografować i rozłożyć na jednej kliszy. Dzięki temu odrazu widać, czy jakiś gen został przeniesiony w inne miejsce chromosomu, lub nie jest powielony albo zupełnie go brak.

Jest to metoda znacznie dokładniejsza od klasycznego badania kariotypu.

Niektóre wirusy tak dalece przystosowały się do życia w naszym organizmie, że integrują się z DNA zainfekowanej osoby. Właściwości takie ma np. wirus HIV, wirus żółtaczki zakaźnej typu B czy wirus HPV wywołujący raka szyjki macicy.

Aby odnaleźć wirusowe DNA, powiela się za pomocą PCR jedynie wbudowany fragment wirusowego genomu. Żeby to osiągnąć przygotowuje się wcześniej krótkie sekwencje komplementarne do wirusowego DNA. Łączą się one z wbudowanym materiałem genetycznym i zostają powielone techniką PCR. Dzięki chromatografii można określić czy, poszukiwany fragment został powielony. Jeśli tak, stanowi to dowód na obecność wirusowego DNA w komórce człowieka.

Istnieje też możliwość oznaczania wirusowego RNA i DNA znajdujące się poza komórkami. W tym celu również wykorzystuje się techniki PCR.

Niektóre ludzkie geny są polimorficzne. Oznacza to, że istnieją więcej niż dwa warianty danego genu. Sekwencje STR (short terminal repeats) posiadają setki a nawet tysiące różnych wersji, dlatego prawdopodobieństwo, że dwoje ludzi ma ten sam zestaw STR jest bliskie zeru. Właśnie dlatego stanowią one podstawę identyfikacyjnych metod badania DNA.

Dzięki porównaniu sekwencji STR można nie tylko udowodnić winę mordercy, identyfikując jego DNA z miejsca zbrodni, ale również wykluczyć lub potwierdzić ojcostwo.

Badanie pojedynczych genów i sekwencjonowanie DNA wciąż jest bardzo drogie. Aby zmniejszyć koszty, naukowcy wymyślili biochipy. Metoda ta polega na połączeniu na jednej płytce bardzo wielu komplementarnych fragmentów DNA, które badałyby obecność setek a nawet tysięcy chorób genetycznych na raz.

Jeśli na takiej płytce DNA pacjenta połączy się z fragmentem komplementarnym odpowiadającym danej chorobie, zostanie to odebrane w postaci sygnału elektrycznego. Cały biochip podpina się do komputera, który na podstawie analizy wielu fragmentów DNA na raz jest w stanie wyliczyć prawdopodobieństwo wystąpienia chorób genetycznych u pacjenta oraz jego dzieci.

Biochipy można również zastosować w onkologii, w celu określenia wrażliwości nowotworu na daną grupę leków. Badania DNA są obecnie wykorzystywane w wielu gałęziach medycyny. Wykorzystuje je się m.in. w testach na ojcostwo, gdzie pozwalają niemal ze 100-procentową pewnością ustalić ojcostwo. Wykorzystuje się je także wykonując testy genetyczne w onkologii.

Źródła

1. Gajda M., Litwin J.A. Podstawy technik mikroskopowych, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellonskiego, Kraków 2011, ISBN 978-83-233-3059-2
2. Berry A., Watson J.D. DNA - tajemnica życia, WAB, Warszawa 2005, ISBN 83-7414-007-0
3. King R.C., Stansfield W.D. Słownik terminów genetycznych, Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań 2002, ISBN 83-85481-69-9
4. Srebniak M.I., Tomaszewska A. Badania cytogenetyczne w praktyce klinicznej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008, ISBN 978-83-200-3489-9