Diagnostyka boreliozy - badania mikrobiologiczne i serologiczne, metoda PCR

Czynnikiem wywołującym chorobę jest bakteria Borrelia burgorferi należąca do rodziny krętków (Spirocheteae). Borelioza objawia sięzespołem zmian dermatologicznych, mięśniowo-szkieletowych, neurologicznych i kardiologicznych. W przebiegu zakażenia można wyodrębnić charakterystyczne, następujące po sobie fazy choroby.

W pierwszym okresie choroby, który rozpoczyna się mniej więcej po 20-30 dniach od momentu wniknięcia bakterii do organizmu w ogromnej większości przypadków, bo w aż 60-80 procentach pojawiają się zmiany skórne o charakterze rumienia wędrującego. W tym stadium mogą pojawić się także łagodne objawy grypopodobne (bóle głowy, podwyższona temperatura, bóle gardła, stawów). Następnie dochodzi do zakażenia kolejnych narządów i układów (obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy, układ kostno-stawowy, układ krążenia).

Oprócz tegou ludzi pojawiają się takie objawy boreliozy jak:

• Naciek limfatyczny – przypomina małą banieczkę wypełnioną płynem. Znajdują się w nim bakterie odpowiedzialne za wywołanie choroby. Naciek może być mylony z odciskiem, ale jego lokalizacja jest inna. Występuje w miejscach, na których odciski się nie pojawiają. Na przykład na małżowinie usznej.
• Objawy wtórne boreliozy – pojawiają się, gdy nie zostanie podjęte leczenie antybiotykami, a infekcja zdąży się już rozproszyć. Do tych objawów boreliozy zaliczamy: zapalenie stawów, zaburzenia neurologiczne i kardiologiczne.
• Postać przewlekła boreliozy – postać przewlekłą osiąga borelioza rok od ugryzienia przez kleszcza. Objawy boreliozy przewlekłej u ludzi są następujące: gorączka, dreszcze, bóle głowy, gardła, stawów, tiki mięśni, sztywność stawów. Osoba pogryziona przez kleszcze może potrójnie widzieć, odczuwać paraliż mięśni twarzy, zawroty głowy. Chory może mieć problemy z mówieniem oraz orientacją przestrzenną.

Zróżnicowane objawy kliniczne boreliozy sprawiają ogromną trudność diagnostyczną, gdyż nie pozwalają na postawienie jednoznacznego rozpoznania. Dokładnie zebrany wywiad od pacjenta, który powala ocenić ryzyko ewentualnego zakażenia, obraz kliniczny i badania diagnostyczne mogą nasunąć prawidłową diagnozę.

Wśród podstawowych metod laboratoryjnych możemy wyróżnić badania bezpośrednie, czyli ocena mikroskopowa drobnoustroju chorobotwórczego, hodowla i izolacja, wykrywanie swoistych dla danych szczepów bakteryjnych antygenów (definiującego daną bakterię zestawu białek) oraz wykrywanie DNA bakteryjnego (definiującego daną bakterię zestawu genów) metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR).

Drugą grupę badań na boreliozę stanowi diagnostyka pośrednia, czyli badania serologiczne przeprowadzana za pomocą metody immunofluorescencji pośredniej, metodą immunoenzymatyczną i techniką Western-blot.

W praktyce klinicznej ogromne znaczenie ma właściwy dobór metod diagnostycznych, sposób przeprowadzania badania oraz odpowiednia interpretacja uzyskanych wyników. Do tej pory nie został opracowany jeszcze żaden test, który w 100 % mógłby potwierdzić lub wykluczyć boreliozę, a wszystkie dostępne obecnie na rynku powinny mieć charakter jedynie wskazujący i pomocniczy.

Z opracowań naukowych oraz z doświadczeń życiowych wynika, że najistotniejsze w rozpoznawaniu laboratoryjnym boreliozy są badania serologiczne, chociaż dużą wartość diagnostyczną ma również hodowla drobnoustojów.

Badanie mikrobiologiczne

Podstawowym postępowaniem mikrobiologicznym jest hodowla i izolacja czynnika chorobotwórczego oraz jego ocena pod mikroskopem. W przypadku boreliozy ta metoda nie jest powszechnie stosowana, gdyż nie jest efektywna. Aby zdiagnozować Borrelia należy przeprowadzić trzy miesięczną hodowlę na odpowiednim podłożu, a uzyskanie wyniku negatywnego nie wyklucza zakażenia.

Borrelia burgdoreri można izolować ze zmian skórnych, płynu mózgowo-rdzeniowego, płynu stawowego i krwi, przy czym najczęściej wyniki dodatnie uzyskuje się ze zmian skórnych pobieranych z widocznego rumienia (50-85 %). Czułość testu (zdolność do rozpoznania drobnoustroju) waha się w granicach 10-30 %.

Badanie antygenów

_Borrelia burgdorferi_jest drobnoustrojem posiadającym swoiste zestawy białek, tak zwane lipoproteiny (Ospa, OspB, OspC i inne), które mogą być wykorzystywane, jako antygeny diagnostyczne. Antygeny te są silnie immunogenne, to znaczy, że po wniknięciu do organizmu odpowiadają za aktywację układu odpornościowego i wywołują przeciwko sobie określony typ reakcji immunologicznej powiązany z produkcją przeciwciał.

Różnice w budowie i składzie poszczególnych białek pozwalają jednocześnie wyodrębnić kilka serotypów, czyli odmian gatunkowych mikroorganizmu. W Stanach Zjednoczonych choroba z Lyme jest wywoływana jedynie przez jeden szczep bakteryjny, a mianowicie Borrelia burgdorferi sensu stricte. W Europie natomiast oprócz podstawowego gatunku opisywane są jeszcze trzy inne patogenne dla człowieka gatunki: _Borrelia garinii, Borrelia afzelii_oraz Borrelia spielmani, w związku z czym, diagnoza mikrobiologiczna jest utrudniona.

Badania serologiczne

Najbardziej wygodnym rozwiązaniem w rutynowo przeprowadzanych badaniach diagnostycznych są, jak już wspominaliśmy wcześniej, badania serologiczne. Dzisiaj na rynku dostępnych jest wiele serologicznych testów komercyjnych, ale istnieje też wiele problemów związanych z ich stosowaniem, poczynając od czasu wymaganego do uzyskania odpowiedniego poziomu przeciwciał, a kończąc na ich czułości i swoistości.

W pierwszym etapie choroby, trwającym około trzech tygodni od zakażenia nie wykrywa się swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom bakteryjnym, co może stwarzać pewne trudności diagnostyczne. Przeciwciała tworzone są w celu eliminacji czynnika chorobotwórczego. Podobnie jak w większości zakażeń pierwsze pojawiają się przeciwciała w klasie IgM. Są one wykrywane w surowicy krwi mniej więcej w 3-4 tygodniu od zakażenia. Najwyższy poziom tych przeciwciał stwierdza się w 6-8 tygodniu, a potem następuje stopniowy spadek.

Niekiedy, nawet pomimo skutecznej terapii poziom (miano) przeciwciał IgM utrzymuje się w surowicy krwi przez bardzo długi czas (miesiące, a nawet lata). Po pewnym czasie trwania choroby pojawiają się przeciwciała w klasie IgG, które stanowią główne immunoglobuliny wystawiane do walki z patogenami. Podobnie jak w przypadku przeciwciał IgM, poziom przeciwciał IgG może utrzymywać się latami, co nie pozwala na wykorzystywanie ich w celu nadzorowania procesu leczenia boreliozy. Należy pamiętać, że na produkcję przeciwciał, a tym samym i na wynik badania może mieć wpływ wcześniejsza terapia antybiotykowa.

Niegdyś do diagnostyki zalecane były testy ELISA, czyli test immunoenzymatyczny (immunoenzymosorbcyjny), który w dobie dzisiejszej stracił na znaczeniu, gdyż niekiedy obserwujemy nieswoiste reakcje krzyżowe i wyniki fałszywie dodatnie. Oznacza to, że test wychodzi pozytywnie w przypadku różnych chorób wirusowych i reumatycznych oraz zakażeń innymi krętkami, a to może przyczynić się do niesłusznego rozpoznania boreliozy.

Takie badanie na boreliozę może być jednak nadal wykonywane (daje około 70% pewności co do wyniku) w laboratorium analitycznym, bezpłatnie w przypadku skierowania od lekarza. W takich przypadkach na wykonanie testu czeka się ok. 3-4 miesięcy. Indywidualnie koszt takiego badania to ok. 60 zł i wykonywane jest natychmiast.

Test ELISA polega na wprowadzeniu materiału biologicznego do odpowiedniego podłoża. W materiale wykrywany jest specyficzny antygen, który wytwarza kompleks immunologiczny z przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym, skoniugowanym z odpowiednim enzymem. Następnie dodawana jest odpowiednia substancja, z której – w wyniku zadziałania enzymu – wytwarza się barwny produkt, który następnie oznaczany jest spektrofotometrycznie. Z otrzymanych wyników wylicza się stężenie antygenu.

Normy w teście ELISA wynoszą:

• wynik ujemny – poniżej 9 j. BBU/ml,
• wynik wątpliwie dodatni – 9,1-10,9 j. BBU/ml,
• wynik nisko dodatni – 11-20 j. BBU/ml,
• wynik wysoko dodatni – 21-30 j. BBU/ml,
• wynik bardzo wysoko dodatni – powyżej 30 j. BBU/ml

W związku z tym obecnie zalecane jest przeprowadzanie dwustopniowej diagnostyki serologicznej. Polega ona na oznaczeniu, w pierwszej kolejności miana przeciwciał testem ELISA (test przesiewowy), a następnie przeprowadzenie weryfikacji wyników pozytywnych i wątpliwie dodatnich testem immunoBlot, (Western-blot, jako test potwierdzający). Test ELISA jest testem półilościowym, a test Western-blot testem jakościowym, który potwierdza obecność konkretnej bakterii w badanym materiale.

Metoda Western-blot oparta jest na wykrywaniu przeciwciał przeciwko antygenom IgM i IgG bakterii krążącym we krwi. Polega na rozdziale w żelu białek (antygenów bakteryjnych) zawartych we krwi i ich identyfikacji. Odpowiedź immunologiczna krętka na poszczególne antygeny koreluje z klinicznym zaawansowaniem choroby.

Czułość tego testu jest większa od testu ELISA. W klasie IgM skuteczność testu wynosi ok. 95% u osób z objawami klinicznymi, w klasie IgG jest jeszcze wyższa, ale istnieje tutaj możliwość nieodróżnienia choroby od blizny serologicznej. Niekiedy błędne wyniki tego testu wynikają z reakcji krzyżowej na antygeny, np. wirusa Epsteina-Barr, cytomegalowirusa czy wirusa opryszczki. W badaniu tym przeciwciała wykrywane są w surowicy krwi. Jest to więc jeden z testów serologicznych.

Najbardziej rzetelne wyniki test daje po ok. 6 tygodniach od wtargnięcia wirusa do organizmu. Istnieje bowiem tzw. okienko serologiczne, tj. czas od momentu wniknięcia krętka, do momentu pojawienia się przeciwciał we krwi. Dlatego też, gdy występuje podejrzenie boreliozy, a wynik badania jest ujemny, należy je powtórzyć po kilku tygodniach, istnieje bowiem możliwość, iż pierwsze badanie było wykonane w czasie owego okienka serologicznego.

Jednakże i w tym przypadku negatywny wynik testu potwierdzającego nie może wykluczyć infekcji Borrelia burgdorferi (nie zdążyły powstać jeszcze przeciwciała, terapia antybiotykami). Jeżeli obraz kliniczny nakazuje podejrzewać boreliozę, a testy serologiczne z surowicy krwi wychodzą ujemne lub są nieoznaczalne, należy powtórzyć badanie po 3-4 tygodniach, w celu ostatecznego potwierdzenia.

W przypadku podejrzenia neuroboreliozy wykrycie przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym jest wystarczającym dowodem potwierdzającym rozpoznanie. Postępowanie diagnostyczne w takich przypadkach polega na równoległym badaniu surowicy krwi i płyny mózgowo-rdzeniowego w dwuetapowej procedurze.

Metoda PCR w diagnozie boreliozy

Pomimo znacznego postępu metoda oznaczeń serologicznych nadal jest trudna i nie daje jednoznacznej odpowiedzi. W przypadkach trudnych diagnostycznie pomocna może okazać się technika reakcji łańcuchowej polimerazy, tak zwana metoda PCR. Umożliwia ona wielokrotne powielanie charakterystycznych dla danego drobnoustroju fragmentów DNA, przez co pozwala na wykrycie nawet pojedynczych, niewielkich fragmentów w tkankach i płynach ustrojowych.

Test PCR to badanie wykazujące obecność DNA krętka Borrelia we krwi lub w moczu pacjenta. Obecnie badanie to nie jest szeroko stosowane, ze względu na dość częste wyniki fałszywie dodatnie.

Odmianą metody PCR, wzbogaconą o sondy fluorescencyjne, jest technika real-time PCR, jedna z najczulszych obecnie dostępnych metod. Pozwala ona na wykrycie pojedynczych komórek bakteryjnych w badanym materiale. Ta metoda, ze względu na swoje zalety w przyszłości zapewne stanie się podstawą diagnostyki boreliozy.

Testy na boreliozę nie zawsze dają 100% pewność, czy pacjent zachorował na boreliozę, czy też nie. Dlatego też pomocniczo wykonywane są także badania płynu mózgowo-rdzeniowego oraz badanie przepływów mózgowych (SPECT). Mają one na celu głównie wykluczenie innych chorób. W przypadku zdiagnozowania choroby należy zastosować odpowiednie leczenie boreliozy.

Źródła

1. Grzeszczuk A. Borelioza w praktyce klinicznej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2009, ISBN 978-83-200-3923-8
2. Boroń-Kaczmarska A. Choroby zakaźne w zarysie, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin 2004, ISBN 83-89318-35-0
3. Tomaszewski J., Diagnostyka laboratoryjna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001, ISBN 83-200-3591-0
4. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W., Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej, Urban & Partner, Wrocław 2009, ISBN 978-83-7609-137-2