Sposoby pobierania materiału do badania mykologicznego

Badania mykologiczne w dermatologii przeprowadza się w przypadku, gdy występuje podejrzenie grzybiczej przyczyny zmiany chorobowej oraz w celu określenia gatunku grzyba chorobotwórczego. Ze względu na to, że grzybice mogą być wywołane przez bardzo dużo różnych grzybów na naszych terenach, np. dermatofity, drożdżaki czy pleśniowce oraz grzyby tropikalne w innych krajach, badanie to ma na celu nie tylko stwierdzenie obecności grzyba chorobotwórczego, ale także określenie jego gatunku.

Grzybica skóry to częsta przypadłość. Na szczęście istnieją metody badań pozwalające na identyfikację rodzaju grzyba, który wywołuje zmiany chorobowe. W ten sposób leczenie grzybicy jest szybsze i bardziej skuteczne. Jeśli istnieją wątpliwości odnośnie tego, czy zaobserwowane zmiany to grzybica, należy przeprowadzić badanie mikologiczne i pamiętać, że grzybicę skóry można wyleczyć.

Przed każdorazowym pobraniem materiału do badania mykologicznego należy upewnić się, że chory nie stosuje aktualnie preparatów o działaniu grzybobójczym lub grzybostatycznym, co może zafałszować wynik. Prócz techniki pobrania w badaniu mykologicznym istotny jest szybki transport materiału do laboratorium, zwłaszcza w przypadku zakażeń drożdżakowych.

W dniu badania nie powinno się myć chorobowo zmienionego miejsca. Stosowanie leków i maści może zafałszować wyniki badania, dlatego można je wykonać najwcześniej po dwóch tygodniach od zakończenia leczenia. Nie powoduje ono skutków ubocznych, może być wykonywane wielokrotnie u każdego, niezależnie od wieku, nawet u kobiet w ciąży.

Dermatofitozy, inaczej zakażenia grzybicze skóry, są diagnozowane poprzez bezpośrednią ocenę materiału pobranego od chorego oraz badanie hodowlane, które umożliwia identyfikację patogenu. Uzupełnienie diagnostyki stanowi oglądanie chorobowo zmienionych miejsc w przefiltrowanym świetle ultrafioletowym (badanie w świetle lampy Wooda) w celu wykazania charakterystycznej fluorescencji ognisk. Sposób pobierania materiału zależy oczywiście od lokalizacji zmian chorobowych:

• w razie zakażeń grzybiczych skóry pobiera się łuski naskórkowe z ognisk chorobowych, poprzez skrobanie ich powierzchni łyżeczką chirurgiczną bądź odwrotną stroną skalpela. Ważne jest uzyskanie materiału również z obrzeża zmiany. W przypadku, gdy obecne są pęcherze lub pęcherzyki, należy również pobrać ich pokrywę,
• w razie dotknięcia zmianami chorobowymi owłosionej skóry głowy pobiera się włosy przy pomocy szczypiec z centrum ogniska oraz łuski naskórkowe z obrzeża zmian. Użyteczne jest wykorzystanie techniki szczoteczka-podłoże, która polega na tym, iż np. szczoteczką do zębów pociera się ognisko chorobowe, a materiał bezpośrednio ze szczoteczki przenosi się na podłoże,
• przy podejrzeniu grzybicy paznokci, wykorzystuje się specjalne cążki, którymi pobiera się materiał z całej grubości chorobowo zmienionej płytki, starając się by było to możliwie blisko granicy z płytką patologicznie niezmienioną. Szczególnie wartościowym materiałem do badania jest zgromadzona pod płytką paznokciową masa rogowa. Gdy zmiany obejmują wały okołopaznokciowe materiał do badania może stanowić wydzielina spod wału. Jeżeli nie ma wydzieliny, umieszcza się pod wałem paznokciowym na kilka lub kilkanaście godzin jałową nitkę nasączoną bulionem Saborauda, która po wyjęciu stanowi materiał do badania hodowlanego. Jeżeli zakażenie grzybicze dotyczy błon śluzowych pobiera się wymazy.

Diagnostyka mykologiczna, przeprowadzana na kilka sposobów, jest niezbędna w rozpoznaniu, diagnostyce i wyborze odpowiedniego sposobu leczenia grzybicy.

Hodowla grzybów w diagnostyce mykologicznej

Hodowla grzybów jest procesem długotrwałym (trwa 3-4 tygodnie), dlatego też badanie preparatu bezpośredniego znacznie przyspiesza diagnostykę mykologiczną. Niemniej jednak i tak należy założyć hodowlę pozostałej części materiału na specjalnym podłożu stałym Saborauda z dodatkiem aktidionu i chloramfenikolu, które hamują rozwój bakterii i grzybów pleśniowych. Na podstawie takich cech makroskopowych kolonii, jak kolor, struktura powierzchni oraz cech mikroskopowych, takich jak układ zarodników i strzępek dokonuje się identyfikacji patogenów.

Badania histopatologiczne w diagnostyce mykologicznej

Niezmiernie rzadko w przypadku grzybicy skóry, identyfikuje się infekcję na podstawie badania histologicznego skóry zmienionej chorobowo. Sporządzone preparaty histologiczne należy barwić przy pomocy specjalnych metod, przede wszystkim metodą PAS (Periodic acid Schiff), gdzie elementy grzyba barwią się fuksyną na ciemnoczerwono, a przez to uwidaczniają się na tle słabo zabarwionej tkanki. Inną metodą barwienia grzybów jest tzw. srebrzenie, czyli impregnacja srebrem, która prowadzi do uwidocznienia się ostrych, czarnych konturów komórek grzyba.

Badanie mykologiczne w przypadku infekcji grzybami pleśniowymi prowadzi się analogicznie. Również przeprowadza się identyfikację gatunkową na podstawie morfologii ocenianej makroskopowo (wygląd kolonii na agarze Saborauda lub Czapek-Doxa) i mikroskopowo (konidia i konidiofory).

Grzybica narządów rodnych a próbka materiału

Podczas badania ginekologicznego w razie obserwacji wydzieliny prócz oceny jej koloru, zapachu i konsystencji należy określić, czy pochodzi ona z pochwy czy z szyjki macicy. Również ważne jest, by przy ocenie pH wydzieliny pobierać ją ze ścian bocznych pochwy, a nie ze sklepienia tylnego, gdzie może być materiał zmieszany z wydzieliną szyjkową.

Pobrany materiał w badaniu mykologicznym ocenia się mikroskopowo z zastosowaniem wodorotlenku potasu (KOH), co zazwyczaj pozwala zaobserwować strzępki grzybni lub pączkujące komórki drożdży. KOH rozpuszcza komórki nabłonka oraz komórki zapalne pozostawiając dobrze widoczne elementy grzybni.

Osobno wykonuje się preparaty bezpośrednie z 10% KOH i z solą fizjologiczną, w celu wykrycia ewentualnej obecności pierwotniaków z witkami, strzępków grzybni i pączkujących drożdży oraz innych mikroorganizmów. Barwienie metodą Gramma, które uwidacznia gęste Gramm-dodatnie owalne organizmy, znalazło zastosowanie, jako szybki test przesiewowy. Również w tym przypadku najczulszą metodą pozostaje hodowla.

W przypadku podejrzenia grzybicy narządowej (tj. głębokiej), jak w przypadku innych zakażeń wykonuje się badanie bezpośrednie oraz hodowlę. Materiałem zastosowanym do przeprowadzenia określonych badań laboratoryjnych może być krew, płyny ustrojowe, plwocina, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL), wymazy z ran, wymazy z górnych dróg oddechowych, płyn mózgowo-rdzeniowy, kał, wycinki, bioptaty, aspiraty, masy martwicze, materiały śródoperacyjne, końcówki cewników.

Diagnoza grzybicy polega na pobraniu do badania materiału z tkanek, które podejrzewa się o zakażenie grzybicze. Rozpoznanie konkretnej grzybicy nie jest trudne, ze względu na charakterystyczny dla poszczególnego gatunku wygląd i układ zewnętrzny lub wewnętrzny zarodników grzyba. Wykonuje się to zasadniczo tępym skalpelem. W niektórych przypadkach wyrywa się włosy w miejscu, które podejrzewa się o grzybicę. Pobraną próbkę bada się w dwóch etapach - badania bezpośredniego i posiewu.

W pierwszym etapie przygotowuje się wspomniane preparaty do badania pod mikroskopem z części pobranego materiału. Materiał umieszcza się na szkiełku podstawowym i na ok. 1/2 godziny do godziny poddaje się działaniu 10-20% roztworu wodorotlenku potasu (KOH) z dodatkiem 40% dimetylosulfotlenku (DMSO), następnie ogląda się w mikroskopie świetlnym przy powiększeniu 400 razy, poszukując strzępek grzybni i zarodników.

Związki te powodują, że zakażony materiał staje się lepiej przepuszczalny dla światła, podczas gdy strzępki grzybni i zarodniki grzyba z powodu zawartości chityny w ścianie komórkowej pozostają niezmienione. W razie stwierdzenia grzybicy skóry owłosionej głowy ocenia się układ zarodników grzybów. Ponadto można wykonać preparat w soli fizjologicznej oraz barwiony metodą Grama, co może ujawnić występowanie blastospor i fragmentów pseudogrzybni.

Źródła

1. Baran E. Mikologia - co nowego?, Cornetis, Wrocław 2008, ISBN 978-83-61415-00-8
2. Błaszczyk-Kostanecka M., Wolska H. Dermatologia w praktyce, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2009, ISBN 978-83-200-3715-9
3. Salyers A.A., Whitt D.D. Mikrobiologia - różnorodność, chorobotwórczość i środowisko, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2010, ISBN 978-83-01-14057-1
4. Virella G. Mikrobiologia i choroby zakaźne, Urban & Partner, Wrocław 1999, ISBN 978-83-85842-59-0